实时搜索: ep管是什么

ep管是什么

398条评论 5770人喜欢 5769次阅读 225人点赞
还有,之前配的1%的肝素钠,2mlep管中加15ul,取了1ml血,抗凝效果不好,血液很快就凝了,取完刚打算摇,中间就已经凝了,按理说加的浓度也够了,量也差不多,为什么凝这么快?请大神指教!真的很疑惑 , 1、是要做PCR和16S吗?做这两个的步骤是怎么样的?
2、引物要怎么选择?
3、G+菌和G-菌选择的引物是不一样的么?

毕业课题要鉴定细菌,但是本科生对于PCR都只是随便提到,很迷茫 , 有正反两面的那种,正面可以固定2.0,1.5的EP管,反面可以固定0.5的EP管。 , 求PT-PCR操作流程 ...

离心时向ep管中加乙腈是什么作用: EP(eppendorf)管是一种小型的离心管.

荧光定量pcr是加样到ep管中还是直接加样到8连管: 一般是做个mix,加到普通pcr管中,然后再分装到8连管中

自制的0.5%肝素钠ep(2ml)管烘干时要打开盖子吗?70℃烘了将近两天了还是没干(盖着盖子烘的): 不要盖盖子,也不要打开盖子,在盖子上开个小孔即可。

细菌的分子生物学鉴定要怎么做?: 是的,要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下:
1、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min)培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中,再加甘油(30-40%)进行保种。(-80摄氏度保藏2年)
2、提取DNA(CTAB法):
(1)取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。
(2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。
(3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混匀,于50℃温育1h。
(4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合后再65℃温育30min。
(6)冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质):氯仿:异戊醇(增强酚的作用)(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。
(7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。(纯化作用)
(8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。
(9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。
(10)加入50ul(双蒸水)/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
(11)电泳检测
6、PCR扩增:(细菌的通用引物为27F和1492R)将提取得到的DNA进行PCR扩增,电泳检测扩增得到的16S rDNA(如果菌类分明,条带清晰,PCR原液可直接送去测序,双向测通,得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对,得出鉴定结果)
7、酶切带型分型确定操作单元:将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切,电泳检测酶切产物,酶切带型相同的分为一个操作单元。
8、连接转化:从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中,将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上,倒置培养12-16h。
9、克隆子挑选及PCR鉴定:从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h,以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定(1000-2000bp)。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。
10、测序:将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。
11、序列拼接:运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。
12、建树:对拼接得到的序列用Blast进行比对,最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。

请问生物行业的朋友,用于固定2.0,1.5EP管的96孔板子(非深孔板)如何清洗?: 1:自来水水浸泡
2:试管刷 加 少量洗衣粉刷洗
3: 自来水冲洗
4:蒸馏水冲洗3遍以上

弱弱的问一下,抗体去除防腐剂怎么办: 离心超滤不会吧抗体超没的,但任何操作都会有损失。
不放心的话还是用透析吧。
不是扎透析袋的方法。
用EP管操作,把EP管的盖子由里向外用小剪刀扎个孔。
加入抗体。
再剪一片透析袋(单层),润湿后,小心贴在管口,要松,小心盖下EP管盖,注意不要弄破了透析袋。
用个橡皮筋绑在EP管口,橡皮筋的另一头绑个小西林瓶,
放到烧杯中透析,EP管由西林瓶拉着,EP管的管口朝下透析。
操作的要点在于,向外扎孔,小心盖EP管盖。如果弄破了透析袋,抗体就没了。
最好先用空EP管多实践几次,熟练了再做。

如何用DEPC处理EP管和枪头?: 灭一次菌就可以了,但要单独灭菌,盒子也要用DEPC水处理,盒子各枪头各灭菌,枪头一般放在铝饭盒里灭菌,用时再放到枪头盒中。

PT-PCR操作流程: 是RT-PCR啊。

一、实验器具与材料:
1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头:1ml、200μl、20μl
3、匀浆管:5ml
4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)
1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、试管架:5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水
11、铝制饭盒:4个
12、塑料小饭盒:1个
13、大瓷缸:2个
14、锡泊纸:一卷
15、卷纸:2卷
16、三角烧瓶:带盖,稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)
三、试剂配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
3、异丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制:
1、电泳缓冲液:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml? pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE (贮存液)
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液,4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制:
1、1.0%:
1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上,将琼脂糖的量改为1.5g

六、需购置的Rt-PCR材料:
(生工. Tel. 2236106.)
Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
(1543. 994. 697. 515. 377. 231)
七、引物合成

正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火温度计算
2(A T) 4(G C)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
5、引物稀释:
加DEPC水量为(μl)
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前,打开离心机预冷。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg

加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)

颠倒混匀10下,室温5分钟

加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)

颠倒混匀10下,室温5分钟

4℃,离心12000g,15分钟

转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中

加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟

4℃,离心12000g,10分钟

弃上清

加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml

4℃离心7500g,5分钟

弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)

溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)

注:
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)
3、RNA在75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年

两步法RT-PCR
(第一步:逆转录反应)
试剂 浓度 体积 终浓度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
(稀释10倍后用)

混匀,离心,70℃ 5min

立即冰水浴,稍离心

试剂 浓度 体积 终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl(20μl)

混匀,离心,42℃ 60min

95℃ 10min(破坏MLV)

4℃保存
两步法RT-PCR
(第二步:PCR反应)
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X

Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl

混匀

97℃,5分钟

立即冰水浴

混匀

95℃ 5分 预变性
94℃ 30秒 变性
X℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 终末延伸
28-36循环,4℃保温
三、电泳:
加1-10μl PCR产物 溴芬兰(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。
注意:Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存,操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。

  • 14岁多少正常

    大哥们腾讯WiFi管家工具在哪里啊,行行好吧,一个个都只有过程之后理都不理我,工具到底在哪T_T: 下载旧版的10.3m的那个,不要2018的版本,名称:wifi管家,左下角有管理,点开就能找到密码选项,打开工具箱,或者root,舒服死他,WiFi管家 ...

    267条评论 5917人喜欢 2279次阅读 682人点赞
  • ipo有多少个交易日

    最贼眉鼠眼的明星是谁: 萝卜青菜各有所爱。每个明星都有优点,都有饭。没有所谓最贼眉鼠眼的 ...

    852条评论 3518人喜欢 3515次阅读 884人点赞
  • 21 9和16 9哪个好

    CISCO2600路由器ARP表: 从这里是很难看出来的,因为当有arp欺骗量时,大部份主机和网关都断开了,欺骗主机也同网关断开! ...

    799条评论 6502人喜欢 2799次阅读 988人点赞
  • 15岁男孩干40岁阿姨会怎样

    路由器上的重启按钮在哪里呢?: 路由器上没有重启按钮,想要重启的话可以直接拔掉电源达到重启的目的,但是对路由器不安全,可以在路由器界面进行设置达到重启的目的,操作步骤如下:1、浏览器界面输入路由器地址,然后进入登录界面,输入密码进行登录。2、输入密...

    463条评论 1765人喜欢 1707次阅读 231人点赞
  • iphone6 plus买哪个

    SD敢达幽灵怎么卡用360的: 那是QQ医生的,安装时安流量监控,然后把流量调到12KB左右就可以了,或者更低 ...

    774条评论 5864人喜欢 5585次阅读 704人点赞
  • dnf怎么看战斗力

    关于交换机问题,电脑移动了或者换了IP就无法上网。ARP表中有地址,但无法PING通。重启交换机后可以上网: PING 的通 ,又上不了网,给人的第一感觉就是路由设置有问题.如果保证路由设置没有问题,那么就是硬件的缘故了,,,扔掉路由,还修什么修... ...

    552条评论 1870人喜欢 3626次阅读 394人点赞